在分子生物學(xué)和生物醫(yī)藥實驗中，
DNA 定量是 PCR 擴增、NGS 建庫和分子克隆等流程中重要的一步。

在實際工作中，很多實驗人員都會依據(jù) A260/A280 比值來判斷 DNA 樣品是否合格。但在一些實驗場景下，即便 A260/A280 數(shù)值正常，后續(xù)實驗仍然可能出現(xiàn)成功率不穩(wěn)定、重復(fù)性較差等問題。

這類現(xiàn)象在超微量 DNA 定量中尤為常見。

A260/A280 正常，并不等于 DNA 定量一定準(zhǔn)確

A260/A280 反映的是 260 nm 與 280 nm 吸光度的比例關(guān)系，
主要用于判斷核酸與蛋白污染情況。

但需要注意的是，A260/A280 本身并不能保證 DNA 濃度測量的準(zhǔn)確性。

在超微量分光定量條件下，如果光學(xué)系統(tǒng)的光程控制或雜散光抑制能力不足，就可能出現(xiàn)以下情況：

• A260/A280 比值正常

• 但 A260 的吸光度存在系統(tǒng)性偏差

• DNA 濃度被整體高估或低估

這種情況下，實驗人員往往難以及時察覺定量誤差的存在。

高濃度 DNA 樣品，反而更容易出現(xiàn)定量誤差

一個容易被忽視的現(xiàn)象是：
高濃度 DNA 樣品在超微量測量中并不一定更可靠。

在高濃度條件下，雜散光、光學(xué)非線性等因素的影響會被放大，可能導(dǎo)致：

• 稀釋前后測得濃度不一致

• 建庫或擴增所需 DNA 投入量計算出現(xiàn)偏差

這也是為什么在 NGS 建庫前，即便 DNA 純度指標(biāo)正常，實驗結(jié)果仍可能波動較大的原因之一。

長期使用后的穩(wěn)定性問題更隱蔽

在一些實驗室中，超微量分光儀在使用初期數(shù)據(jù)表現(xiàn)良好，但在使用 2–3 年后，逐漸出現(xiàn)以下情況：

• 定量數(shù)值表面上仍然穩(wěn)定

• 實驗重復(fù)性卻有所下降

這類問題往往并非設(shè)備故障，而是光學(xué)系統(tǒng)長期穩(wěn)定性不足引起的緩慢漂移。

由于 A260/A280 比值變化不明顯，這種風(fēng)險往往難以通過常規(guī)指標(biāo)直接發(fā)現(xiàn)。

為什么公共平臺和企業(yè)實驗室更關(guān)注“長期一致性"？

在高校公共實驗平臺和生物醫(yī)藥企業(yè)實驗室中，
DNA 定量的核心需求不僅是“單次測量準(zhǔn)確"，更重要的是：

不同人員、不同時間、不同批次測得的結(jié)果具有可比性。

因此，這類用戶在評估超微量 DNA 定量方案時，往往更加關(guān)注：

• 光學(xué)系統(tǒng)一致性

• 雜散光控制能力

• 長期重復(fù)性和穩(wěn)定性

在實際應(yīng)用中，一些實驗室在進(jìn)行方案評估時，會將強調(diào)光學(xué)穩(wěn)定性的超微量分光解決方案，作為常規(guī)方案之外的補充選擇。例如，部分用戶會關(guān)注像 IMPLEN 這類更偏工程穩(wěn)定性設(shè)計思路的產(chǎn)品。

技術(shù)建議

如果在實際工作中遇到以下情況：

• DNA 稀釋前后濃度不一致

• A260/A280 正常，但實驗結(jié)果不穩(wěn)定

• 不同時間測量同一樣品存在波動

建議從定量方法和設(shè)備穩(wěn)定性角度進(jìn)行系統(tǒng)性評估，而不僅僅依賴單一指標(biāo)判斷。

在很多情況下，問題并不出在樣品本身，而是定量結(jié)果的可靠性需要重新確認(rèn)。